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您有没有想过 流式细胞术如何 实现如此精确和可靠的细胞分析？获得准确结果的关键在于正确的细胞固定。流式细胞术使研究人员能够研究各种细胞特征，从大小到荧光强度。然而，如果没有适当的固定，数据可能无法反映真实的细胞特性。在本文中，我们将探讨流式细胞术中细胞固定的重要性，讨论不同的固定方法，并分享获得最佳结果的技巧。
细胞固定是通过防止细胞结构、功能和分子组成发生变化来稳定和保存细胞的过程。这个过程是通过化学交联蛋白质、脂质和其他细胞成分来实现的，有效地将细胞“冻结”在当前状态。这在流式细胞术中尤其重要，因为它可以防止分析过程中细胞标记物的降解或细胞结构的改变。通过固定细胞，研究人员可以确保细胞的特性保持一致，从而在流式细胞术分析过程中实现精确的测量和可靠的数据。
正确的固定至关重要，因为它可以保持细胞蛋白质和核酸的完整性，这对于准确的流式细胞术分析至关重要。如果细胞不固定，它们的结构和分子标记可能会随着时间的推移而降解或改变，从而导致不可靠和不准确的结果。固定在稳定细胞以进行多参数分析方面也发挥着关键作用，这是流式细胞术的关键优势之一。它允许研究人员在一次实验中同时评估多种细胞特征，例如表面标记、细胞内蛋白质和 DNA 含量。如果没有适当的固定，获得的数据可能不一致或不完整，从而导致对实验结果的误解。
多聚甲醛 (PFA) 是流式细胞术中使用最广泛的固定剂之一，主要是因为它能够有效地保持细胞形态和抗原性。它通过交联细胞内的蛋白质发挥作用，确保细胞结构和表面蛋白质保持完整。这使得 PFA 成为保存细胞表面标记的绝佳选择，特别是在免疫表型实验中分析表面蛋白表达时。
推荐：
● 浓度：2-4% PFA 通常用于最佳固定。
● 固定时间：细胞应在 PFA 中于 2-8°C 孵育 15-30 分钟。
● 保存：固定后，细胞应于2-8°C保存，以便短期保存。重要的是不要长时间储存固定细胞，因为这可能会导致标记完整性丧失。
避免过度固定非常重要，因为长时间暴露于 PFA 会导致细胞自发荧光并干扰随后的染色和分析。始终使用所需的最短时间进行固定。
当分析的重点是 DNA 含量时，例如在细胞周期研究中，通常使用乙醇固定。乙醇是一种脱水剂，其作用是穿透细胞膜并保留细胞内的 DNA。这使得乙醇固定对于检查细胞周期阶段或 DNA 含量的 DNA 测定和流式细胞术分析特别有用。
推荐：
● 浓度：通常使用70-100% 乙醇。
● 固定时间：乙醇固定通常需要 10-15 分钟才能获得最佳结果。
乙醇固定非常适合保存细胞周期阶段，并且可以与 DNA 结合染料（例如碘化丙啶 (PI)）结合使用进行细胞周期分析。
甲醇是另一种常用的固定剂，特别是对于细胞内分析。它的作用是穿透细胞膜并稳定细胞的内部结构。虽然甲醇可以有效保存细胞蛋白质和抗原，但它会导致细胞收缩，这可能会影响某些特征的解释，例如细胞大小和形态。
推荐：
● 浓度：通常使用90-100% 的甲醇。
● 固定时间：通常10-15分钟就足够了。
在研究细胞内蛋白质时，特别是在检查细胞质或细胞核内的标记物时，经常使用甲醇固定。然而，研究人员应考虑使用甲醇固定时细胞收缩的可能性。
福尔马林是一种甲醛水溶液，是流式细胞术中使用的另一种固定剂，但它不如 PFA 常见。福尔马林广泛用于组织学和免疫组织化学，可有效保存组织样本以进行显微分析。尽管福尔马林可以保留细胞结构，但通常不建议用于流式细胞术，除非使用固定的组织样本，因为它会干扰细胞分选和一些荧光应用。福尔马林固定最适合组织样本，而不是单个细胞。
固定剂 | 专注 | 固视时间 | 推荐使用方式 |
多聚甲醛 (PFA) | 2-4% | 15-30分钟 | 非常适合保存细胞表面标记；常用于免疫表型分析 |
乙醇 | 70-100% | 10-15分钟 | 最适合 DNA 含量分析和细胞周期研究 |
甲醇 | 90-100% | 10-15分钟 | 适用于细胞内蛋白质分析；可能会导致细胞萎缩 |
福尔马林 | 10%（甲醛） | 变化（取决于组织） | 一般用于固定组织样本，不适用于单个细胞 |
固定之前，必须从组织或血液样本中分离细胞。离心是浓缩悬浮液中细胞的最常用方法。彻底清洗细胞以去除任何培养基或残留污染物也很重要，因为它们可能会干扰固定过程。
1. 细胞分离：使用标准分离方法如离心或细胞分选来分离感兴趣的细胞。
2. 洗涤：用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，以去除可能影响固定过程的残留培养基和污染物。
准备好细胞后，下一步是将固定剂添加到细胞悬浮液中。流式细胞术最常用的固定剂是 2-4% PFA 溶液。
1. 将固定剂添加到细胞悬液中，确保充分混合。
2. 将细胞与固定剂在 2-8°C 下孵育 15-30 分钟。
3. 孵育后，用 PBS 清洗细胞两次，去除多余的固定剂。
固定后，必须小心处理细胞。如果需要进一步分析，应在分析前对细胞进行染色。如果您计划储存细胞以供将来分析，请将它们重新悬浮在适当的缓冲液中并储存在 2-8°C 下。避免将细胞长时间留在固定液中，因为过度固定会导致自发荧光增加和信号质量降低。
当细胞暴露于固定剂的时间过长时，就会发生过度固定，这可能导致细胞蛋白质过度交联并损害数据质量。这可能会导致自发荧光、抗体结合减少以及流式细胞术测量不准确。请务必检查针对您的特定细胞类型和实验的建议固定时间，以避免过度固定。
最佳固定时间可能因细胞类型和实验性质而异。例如，免疫细胞可能需要比组织样本更短的固定时间。根据样品类型的具体需要调整固定时间。对于表面蛋白分析，较短的固定时间（10-15 分钟）通常就足够了。对于细胞内染色或 DNA 分析，可能需要更长的固定时间。
固定细胞后，用抗体或荧光染料染色是流式细胞术分析的关键步骤。一些荧光染料，特别是串联染料，可能对固定敏感，如果细胞过度固定，可能会降解。为了获得最佳染色结果，建议尽可能在固定前对细胞进行染色。这有助于防止染料降解并确保更强的荧光信号。
对于短期储存，固定细胞可储存在 2-8°C 的冰箱中。当您计划在固定后一两天内分析细胞时，这是理想的选择。始终将固定细胞储存在黑暗中，以防止光漂白，光漂白会影响荧光信号。
为了长期保存，可以将细胞冷冻在冷冻保存介质中。典型的冷冻保存介质由 10% 二甲基亚砜 (DMSO) 和 90% 胎牛血清 (FBS) 组成。然而，无血清冷冻保存解决方案（如 mFreSR™ 或 CryoStor™ CS10）也可用，可用于避免与 FBS 相关的问题。为防止冰晶形成，请使用控速冰箱冷冻细胞。这有助于维持细胞活力并确保适当的储存。
固定不当会导致多种问题，包括自发荧光、抗体结合减少和细胞活力差。这些问题会显着影响流式细胞术结果的准确性和可靠性。请务必验证特定样品类型的固定方案，并确保固定条件适合所分析的细胞类型和标记物。
为流式细胞术实验选择合适的固定剂对于获得可靠和准确的结果至关重要。不同的固定剂更适合不同的应用。例如，PFA 通常用于表面蛋白分析，而乙醇是基于 DNA 的研究的理想选择。在开始实验之前，请研究适合您的特定应用的最佳固定剂，并相应地调整固定方案。
正确的细胞固定对于成功进行流式细胞术分析至关重要。它有助于保护细胞结构并确保蛋白质和 DNA 的完整性。通过遵循正确的固定方案并避免过度固定，研究人员可以提高数据的准确性和可靠性。为您的实验选择合适的固定剂可以提高结果的整体质量。实施这些最佳实践可确保您的流式细胞术分析提供一致、可重复的细胞功能见解。
正确的细胞固定在流式细胞术中起着关键作用， HKeybio的产品 提供可靠的解决方案。他们的产品可确保高质量的结果，并受到全世界研究人员的信赖，可进行准确的细胞分析。
答：细胞固定在流式细胞术中至关重要，因为它可以保留细胞结构并确保蛋白质和 DNA 的完整性以进行准确分析。
答：通常应使用 2-4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液固定细胞 15-30 分钟，以保持细胞完整性。
答：是的，乙醇固定通常用于流式细胞术中的 DNA 含量分析，特别是细胞周期研究。
答：过度固定会导致过度交联，导致自发荧光和抗体结合不良，这可能会影响流式细胞术结果。
